1、科学问题及细胞模型过继性T细胞转移免疫治疗(ACT)是一种利用患者自身肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因修饰的T细胞治疗恶性肿瘤的方法,在近年来的临床治疗中取得了良好的效果(没错,著名的“CAR-T免疫治疗”就是其中之一)。这一治疗的主要流程为:提取患者体内肿瘤浸润T细胞—T细胞筛选、基因工程改造—输回患者体内。其中,第二个步骤的T细胞筛选是关键步骤,维持T细胞的适应性、扩增分化等多种特性对增强T细胞的抗肿瘤效果非常重要,然而目前的干预药物只能对其中某一个因素作用,往往顾此失彼,无法达到理想的效果。本研究试图通过CRISPR/Cas9文库筛选找到既能增强T细胞抗肿瘤作用,又能保留新抗原特异T细胞群落的药物靶点。科学问题:在ACT治疗的T细胞培养过程中,筛选敲除后能提高T细胞杀伤肿瘤能力的激酶筛选细胞:TCR激活的小鼠CD8+T细胞 2、CRISPR文库构建使用文库:包含25个激酶的激酶库,每个激酶设计3条sgRNA,4个表型分为4组,每组设置2个重复。选取无靶向(阴性对照)和β2m(阳性对照)的sgRNA加入库中。3、CRISPR文库筛选筛选表型:① 细胞增长 ② 细胞干性(记忆标志物CD62L) ③ 氧化压力(ROS) ④ DNA损伤压力(标志物γH2AX)筛选方法:流式细胞仪分别分选表型为细胞增长加快、CD62L上调,ROS下调、γH2AX下调的T细胞。